Western Blot常见问题及建议

Western Blot是非常经典的分子生物学实验，迄今已有419142篇（pubmed，2022）文献发表。若想得到高质量条带，实验中有很多内容值得探讨优化。在分析问题之前，先明确两个概念：蛋白（免疫）印迹和Western Blot。两者时常通用。严格区分，蛋白（免疫）印迹，是指将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF或硝基纤维素膜上，然后对蛋白质进行免疫检测（1979，Towbin. etal）。Western Blot（WB）包含印迹前蛋白样本制备和凝胶电泳分离步骤（1981，Burnette.etal）。 

注意：良好的实验操作习惯是实验成功与否的关键。在蛋白实验过程中，应注意保持实验环境和用具干净，尽量低温，以防降解。

1、WB结果中无信号或显示信号弱?

(1) 检测样本不表达目的蛋白，建议选择表达量高的组织或细胞作为阳性对照。

(2) 检测样本低表达目的蛋白，可提高上样量。

(3) 样本裂解不充分，如：核蛋白，建议使用强裂解液，充分释放核蛋白。

(4) 蛋白被降解，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂，操作过程中注意保持干净，避免引入蛋白酶，样本避免反复冻融。

(5) 电泳时上样量不足，在上样前可用UV、BCA等方法测定浓度。总蛋白上样量~20ug。

(6) 膜选择不当，导致转膜不完全或者透膜。20kD以下可选用0.22uM PVDF膜，＞20kD可选用0.45uM。

(7) 转印不完全或过转印，可观察蛋白marker转印情况，并用丽春红染膜确定条带是否转至膜上或转过；适当调整转膜的时间和电流。

(8) 抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够识别测试种属的对应蛋白。

(9) 一抗孵育时间不足或者浓度不够，建议提高抗体浓度或4℃结合过夜。

(10) 二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。

(11) 洗膜过度。洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

2、WB结果中杂带较多?

(1) 目的蛋白有多个修饰位点（如：磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

(2) 目的蛋白有其它剪切本。查阅文献或生物信息学分析可能性。

(3) 样本处理过程中目的蛋白发生降解。加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

(4) 上样量过高或上样过程中泳道蛋白污染。适当减少上样量。

(5) 一抗特异性不高。重新选择或制备高特异性的抗体。

(6) 一抗不纯。纯化抗体或者重新采购抗体。

(7) 一抗或者二抗浓度偏高。降低抗体浓度。

3、WB结果中背景较高?

(1) 膜封闭不够。延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

(2) 一抗稀释度不适宜。增大稀释倍数或者对抗体进行滴度测试，选择*适宜的抗体稀释度。

(3) 一抗孵育的温度偏高。建议4℃结合过夜。

(4) 膜在实验过程中干过。实验过程中要注意保持膜的湿润。

(5) 检测时曝光时间过长。减少曝光时间。

(6) 不小心接触到膜面。建议使用镊子夹膜角，避开蛋白。

4、WB结果中条带变形或弥散？

(1) 蛋白上样量过高，条带可能分辨率低、有纵向条纹且不直。

(2) DNA污染，样品太黏稠，条带可能过于狭窄扭曲。上样前先去除基因组DNA。

(3) 盐离子浓度（NaCl）、去垢剂浓度、RIPA缓冲液浓度过高，可能引起泳道宽度不一致，泳道变宽。可通过透析、沉淀或脱盐降低样品的盐浓度。

(4) 裂解液或样品缓冲液中还原剂过多，可能导致泳道边缘有阴影。SDS-PAGE中，还原剂 DTT或 TCEP终浓度应小于50 mM，β-巯基乙醇终浓度应小于 2.5％。

(5) 凝胶放置时间过长，尤其偏碱性凝胶，聚丙烯酰胺可能慢慢水解成聚丙烯酸。

(6) 过量硫酸铵可能导致哑铃型条带，或泳道变宽。

(7) 凝胶不均匀或玻璃底板有气泡，可能导致皱眉型条带。

(8) 电压太高，凝胶过热会使条带扭曲或边缘呈微笑型。使用 8V/cm 电压直到溴酚蓝前沿穿过积浓缩胶，然后提高到10-15V/cm。增加预冷缓冲液或在冰浴环境电泳。

5、其它现象可能原因及建议：

(1) 膜上多处出现黑点或黑斑。抗体与封闭试剂发生非特异性结合。

(2) 反白（条带显白色）。目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

(3) 蛋白分子量偏低或偏高。胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。浓缩胶浓度均为 5%。分离胶的选择：蛋白分子量很小时，推荐使用10-12%，例如蛋白分子量为 21kD 和 34kD ，选取的胶浓度为10%；分子量80kD，选10%；分子量180kD，选6%。