SDS-PAGE 实验常见问题及回答

聚丙烯酰胺凝胶电泳已是一项成熟完善的技术，但实验中仍存在一些需要特别注意或者改进的问题。实验中常遇到的问题及回答如下。

问题：与蛋白质分子质量标准相比，蛋白质没有迁移到期望的位置？

    •由于氨基酸残基组成和序列不同，结合SDS的量有差异，因此具有同样理论分子量的蛋白质其表观分子量常常与理论值有出入，有时甚至偏差很大。

    • 除了蛋白质降解外，非人为的剪切或翻译错误都能导致产生截短的蛋白质。重新检查表达该蛋白质的 DNA 序列中是否存在稀有密码子、内部起始密码子或终止密码子，或其他导致不完全翻译的基因突变。

问题：蛋白质条带染色不佳，呈弥散状，或者染色开始后条带消失？

    • 这种在染色和脱色过程中发生条带弥散的现象，大多通常出现于小分子蛋白质（低于 12kDa）实验。使用更快速的染色方法并尽量缩短各操作步骤之间的时间能够改善条带形状。

    • 非常小的蛋白质（低于 4kDa）可能需要能与蛋白质形成共价交联的固定剂， 如甲醛或戊二醛。染色前，将凝胶放在用于银染的固定液中，轻轻摇振， 室温孵育至少 1h 或孵育过夜。用去离子水清洗 3 次，每次 30s,然后进行考马斯亮蓝染色。当然，从凝胶中能回收到的固定后的蛋白质会大幅减少。

    • 凝胶脱色时间太长，仅需重新染色即可。

    • 蛋白质加样量不足。考马斯亮蓝染色*低只能检测到 0.lug 的蛋白质条带。如果考马斯亮蓝染色不够灵敏，可以把凝胶冲洗后再进行银染。

问题：凝胶边缘的染料前沿及条带呈向上弯曲状（“微笑状”）或向下弯曲状（“皱眉状”）？

    • “微笑状”条带可能是由于凝胶横向温度不均匀引起的，凝胶边缘附近的间隔条起到了散热器的作用。这个问题可以通过以下措施解决：使用主动控制温度（如将电泳设备置于 4°C 环境中），向外槽加入更多的缓冲液以散热，和/或降低电泳功率。过热能够引起条带扭曲，甚至会导致玻璃板碎裂。

    • “皱眉状”条带可能是由于电的不连续导致的不均匀电场（如玻璃板底部有气泡等）或凝胶厚度不一致引起的。凝胶边缘不完全聚合也能导致“皱眉状”条带。因此，在电泳开始前需要确保凝胶中或凝胶底部没有气泡， 并且凝胶已经完全聚合。

问题：蛋白质条带分辨率不够？

    • 可能需要优化丙烯酰胺单体浓度、双丙烯酰胺浓度或电泳时间。一般而言， 高浓度的胶和更彻底的交联能够提高小蛋白质的分辨率，大蛋白质则反之。增加双丙烯酰胺交联剂的量可减少基质的孔径大小，同时也会影响表 19-5 给出的丙烯酰胺总浓度参考值。延长电泳时间可提高较大蛋白质的分离效 果。电泳过程中使用预染分子质量标准品有助于蛋白质条带的分离观察。

    • 在某些情况下，彼此接近的蛋白质条带可通过减少加样量或降低蛋白浓度提高分辨率，这样蛋白质条带会变得更细。

问题：蛋白质条带呈弥散状、条纹状或模糊不清？

    • 配试剂尽可能使用超纯水。

    • 使用 Tris 碱制备缓冲液至关重要。如果缓冲液用 Tris-HCl 制备，离子强度高，导致积层胶压胶效果差，从而出现弥散的条带。

    • 样品中高浓度的盐可以导致条带失真。可通过透析、沉淀或脱盐降低样品的盐浓度。

    • 电压可能太高。使用 8V/cm 电压直到漠酚蓝前沿穿过积层胶，然后提高到10-15V/cm。

    • 聚集性物质会积聚在胶孔中，并在电泳过程中慢慢溶解，从而产生条纹状。

    • 疏水性蛋白，如含有多个跨膜结构域的蛋白质，在煮沸时可能会发生聚集或寡聚化。为避免这个问题，可将这些样品在45-55℃条件下温浴10-60min 变性。对于其他的不溶性蛋白，可加入 4-8mol/L 尿素或增加 SDS 的浓度使其溶解。