蛋白质分子量标准

蛋白质由于氨基酸序列和卷曲折叠的高级结构的不同表现为不同的形状大小和等电点，真核生物表达蛋白质还有各种修饰如磷酸化、糖基化的影响。因此蛋白质的分子量标准根据应用的不同分为：天然蛋白质分子量标准，SDS-PAGE蛋白质分子量标准。

天然蛋白质标准

    通常包括鸡溶菌酶，鸡卵清白蛋白，牛血清白蛋白等，有的蛋白质由多个亚基组成，用于分子筛层析和非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳等。

SDS-PAGE蛋白质分子量标准：

  聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是根据蛋白质分子的电荷、形状和大小来分离的。当蛋白质结合大量SDS后（多肽链结合SDS达到饱和结合时，结合重量比为1:1.4，平均每1.87个氨基酸残基结合一个SDS分子），可以屏蔽蛋白质本身电荷的影响，并形成棒状结构。因此SDS-PAGE蛋白质迁移距离基本只与肽链长度相关，通过蛋白质分子量标准可以测定蛋白质表观分子量。

      SDS-PAGE蛋白质分子量标准由单肽链蛋白质组成，包括非预染蛋白质分子量标准，预染蛋白质分子量标准，Western Blot蛋白质分子量标准，荧光标记蛋白质分子量标准。

                         附图为10%凝胶，pH7.2 SDS-磷酸盐缓冲系统

SDS非预染蛋白质分子量标准

  由于蛋白质和多肽链的氨基酸残基组成和序列不同，结合SDS的量有差异，因此具有同样理论分子量的蛋白质其表观分子量常常与理论值有出入，有时甚至偏差很大。在不同缓冲体系中，不同蛋白质分子量标准条带也会因为侧链基团的组成序列不同而有一些迁移率的变化。因此选用一些特定的常用天然蛋白质组合成为非预染蛋白质分子量标准。

           常用SDS-PAGE蛋白分子量标准的天然蛋白质

       经典采用的天然蛋白质标准品（分子量单位：kDa)是：14.4（鸡卵清溶菌酶），20.1（大豆胰蛋白酶抑制剂），31.0（碳酸酐酶），45.0（鸡卵清白蛋白），66.2（牛血清白蛋白），有的根据实际需求增加条带，如：97.4（磷酸化酶B）。

      Thermo公司提供天然蛋白质标准品（货号：26610，单位：kDa）：14.4（鸡卵清溶菌酶），18.4（牛奶β-乳球蛋白），25.0（限制性内切酶 Bsp98I），35.0（猪肌乳糖脱氢酶），45.0（鸡卵清白蛋白），66.2（牛血清白蛋白），116.0（大肠杆菌β半乳糖苷酶）。

       根据这些天然蛋白质分子量标准，各公司提供重组表达分布均一的（非预染）蛋白质分子量标准品（protein ladder），主要的有Biorad1610363（10-250kDa；10,15,20,25,37,50,75,100,150,250），Thermo26614（10-200kDa；10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200），Thermo26632（3.4-100kDa；3.4,5,10,15,20,25,30,100）。

        X-biotech非预染蛋白质ladder：

  范围从2-450kDa，均是通过大肠杆菌重组表达，均一组成的重组多肽。即用型，不需要煮沸和还原，保存简便，稳定。生产中，即将提供。

SDS预染蛋白质分子量标准

  非预染蛋白质分子量标准品需要染色后才可见，特别是天然蛋白质分子量标准需要煮沸和还原，操作不方便，因此发展了预染蛋白质分子量标准品。预染蛋白质分子量标准品在多肽的某些氨基酸残基侧链基团共价连接染料基团，这样不仅可以监控电泳过程和电泳质量，而且可通过条带色彩直观估计蛋白分子量大小及蛋白质转膜效果，因此得到了广泛应用。

  预染蛋白质表观分子量会由于染料基团的影响，表现与原有蛋白质和多肽不同的表观分子量，而且在不同的缓冲体系中表现出不同的表观分子量。因此在使用不同的缓冲液系统电泳时，预染蛋白质分子量标准品表观分子量，需要使用非预染蛋白质分子量标准品进行标定。

      X-biotech预染蛋白质分子量标准

  采用均一序列组成的大肠杆菌重组蛋白质通过均一定点标记而成，具有如下突出优点：

  1.条带组成均一好，不会因为缓冲体系不同的原因造成条带相对位置的变动。

  2.分子量经Biorad1610363，Thermo26614, Thermo26632非预染蛋白质分子量标准品准确标定。蓝色和绿色条带表观分子量在不同缓冲体系基本没有变化（如：Tris-Glycine，Bis-Tris，Tris-Acetate，Tricine）或者变化极小（Hepes-Tris），可以替代非预染蛋白质分子量标准品使用。橙（红）色条带在Bis-Tris，Tris-Acetate，Hepes-Tris预制胶（和部分改良的Tris-Glycine预制胶）中，表观分子量较标示分子量小10%，变化跟进口品牌变化基本一致。

  3.覆盖1.5-400kDa全范围，条带数量多且分布均衡。

  4.产品极其稳定。经过测试，X-biotech预染marker（10-180kDa）25℃放置35天带型几乎无变化；37℃放置28天仅180kDa大分子条带稍变弱，不影响使用；50℃放置9天仅180kDa大分子稍变弱，不影响使用。80℃对X-biotech小分子条带影响小，大分子逐渐变弱。大分子条带逐渐变弱可能是高温导致蛋白不可逆变性，溶解度降低。

  5.条带不易脱色，色彩鲜亮，适应广泛使用的各种缓冲体系。

SDS Western Blot蛋白质分子量标准

  Western Blot蛋白质分子量标准：其多肽链带有抗体结合基团，可以与待测蛋白样品一起转膜和显色。

  X-biotech Western Blot蛋白质分子量标准

  从10kDa-300kDa，包含多个货号，产品正在生产中。

SDS 荧光标记蛋白质分子量标准

  荧光标记蛋白质分子量标准: 蛋白肽链包含荧光标记信号，可通过检测荧光信号识别蛋白条带。

  X-biotech 荧光标记蛋白质分子量标准开发中。

根据电泳图谱计算表观分子量         

     （1）确定测量基线，不连续胶从分离胶界面开始计算，梯度胶从加样孔底部开始计算。     

     （2）测量电泳条带的溶剂前沿相对于基线的距离，测量电泳条带的上沿相对于基线的距离，计算相对迁移率。

     （3）以蛋白质分子量标准的分子量和迁移距离或相对迁移率做回归曲线。线性拟合蛋白质分子量与迁移距离通常40kDa以上成幂曲线，20-100kDa成对数曲线，30kDa以下成指数曲线。

     （4）根据蛋白样品迁移距离或相对迁移率通过回归方程计算目标蛋白表观分子量。