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质粒DNA提取试剂盒---小量
    发布时间: 2017-07-31 15:57    

组分

6

Mini离心柱

6

1.5ml离心管

6

溶液P1

1.6ml/×1

溶液P2

1.6ml/×1

溶液P3

1.6ml/×1

RNase A

1

溶液 TE

2ml/×1

说明书

1


【储存条件及有效期】

添加过RNaseA的溶液P1长期保存应置于2-8℃ 。其他试剂均室温避光保存。

保质期:添加RNaseA的溶液P1置于2-8℃可保存12个月。其他试剂室温可保存36个月。

 

【产品介绍】

本试剂盒采用无胍盐质粒纯化。目前广泛应用的基于硅胶吸附的DNA纯化技术的共同缺点是需要使用有毒的蛋白变性剂胍盐。DNA产物中存在的痕量胍盐会影响下游的实验(例如:酶切,转化,测序和连接等等)。本试剂盒无胍盐质粒纯化系统有如下的优良特性:

高纯度的纯化质粒DNA。既没有胍盐残留,也没有离子交换树脂脱落物的残留。提高了测序、连接、转化和酶反应效率。

操作方便,费时少。

【使用前准备】

观察溶液P2是否有沉淀。如果室温过低致溶液P2出现沉淀时,40℃-50℃水浴10min,溶液澄清后摇匀即可使用。

使用前,讲RNase A溶液短暂离心后,取10μl移入一瓶将要使用的溶液P1管中,混匀后标记备用(注意:添加RNase A的溶液P1需2-8℃保存)。

全部离心均在室温进行,低温不利于去除RNA。

本产品单次最多可提取50μg质粒。高拷贝质粒推荐菌液用量为1-4ml。低拷贝质粒需加大菌液用量。

菌液量与P1的体积比为10-20:1,溶液P1、P2、P3的用量比为1:1:1。

用户自备试剂与材料:无水乙醇,80%乙醇(v/v),1.5ml离心管。

【提取步骤】

1. 取大肠杆菌过夜培养液(高拷贝质粒) 1~ 4ml于离心管(自备)中,   13000 rpm离心30 sec。弃去上清液,向沉淀中加入P1 溶液(添加过RNaseA200µl,充分混悬细胞。

2. 加入P2溶液 200 µl,上下颠倒使之充分混匀,室温静置 2 ~ 5min

注:混匀时不可漩涡剧烈震荡,以免基因组DNA污染。静置时间越短超螺旋DNA比例越高。当溶液变澄清时说明细胞已被充分裂解,即可进行下一步。放置时间勿超过5 min。当超过5 min液体仍未澄清时,表明菌体过多造成裂解不彻底

3. P3溶液 200 µl颠倒混匀。再加入100 µl无水乙醇(自备)颠倒混匀。最高转速(12000 g 13000 rpm以上)离心5 min

4. 将上清液全部移入套有收集管的mini离心柱中(注:小心操作,切勿吸入絮状物)最高转速12000 g 13000 rpm以上)离心1 min。取出离心柱,弃去收集管中废液,将离心柱放回收集管中。

5. 向离心柱中加入80%乙醇(自备)650 µl 最高转速(12000 g 13000 rpm以上)离心30 sec。取出离心柱,弃去收集管中废液,将离心柱放回。

6. 重复步骤5”一次。

7. 最高转速(12000 g 13000 rpm以上)离心2 min

8. 将离心柱取出并放入新的1.5ml离心管中。向柱中加入TE溶液60- 100µl

 

 

9. 静置2~3 min最高转速(12000 g 13000 rpm以上)离心1 min。质粒溶液即被收集在离心管中。

注:将溶液TE预热至50~60℃时使用可提高洗脱效率。

问题

原因

解决办法

得率低

 

细菌裂解不完全

加入溶液P2之前用移液枪头或在旋涡合器上充分混悬细菌

大肠杆菌生长过度或不新鲜

大肠杆菌培养勿超过12-16小时。将细菌离心沉淀后,如不马上纯化应保存于-20。不要放在4过夜

低拷贝质粒

使用更多的细菌培养液。 溶液P1P2P3的用量加倍

无质粒DNA

抗菌素失效,大肠杆菌丢失质粒

重新培养

基因组DNA污染

溶液P2后放置时间太久

溶液P2后混合时不要太激烈。

放置不要超过5分钟

RNA 污染

忘记加RNase A

溶液P1中加RNase A

电泳时质粒漂浮出加样孔

离心柱中有乙醇残留。

步骤“7”不可省略