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CCK8
    发布时间: 2017-07-27 16:25    

产品描述

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)细胞增殖与活性检测试剂盒,是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速高灵敏度检测试剂盒。其主要成分为水溶性四唑盐WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)。

WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜(formazan,参考图1)。WST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

 

1:WST-8分子结构及检测原理

WST-8MTT的一种升级替代产品,和MTT或其它MTT类似产品如XTTMTS等相比有明显的优点:

² MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲臜不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解;而WST-8XTTMTS产生的甲臜都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。

² WST-8产生的甲臜比XTTMTS产生的甲臜更易溶解。

² WST-8XTTMTS更加稳定,使实验结果更加稳定。

² WST-8MTTXTT等相比线性范围更宽,灵敏度更高。

² WST-8WST-1相比,检测灵敏度更高,更易溶解,并且更加稳定。

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测,也可以用于对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测,或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的增强型CCK-8溶液,无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素,所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞,不必收集细胞,也不必采用额外的步骤去溶解甲臜。可以用于大批量样品的检测。

酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

WST-8对细胞无明显毒性。加入增强型CCK-8溶液显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,便于找到最佳测定时间。

注意:

² 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

² 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得与食品和药品混放。

运输与保存方法

冰袋运输。CCK-8在4℃避光可保存一年,在-20℃避光可以存放数年。反复冻融会造成测定背景O.D值升高,如经常使用,建议存放于4℃即可。

操作方法

1. 在96孔板中配制100 μL的细胞悬液,细胞毒性实验每孔加入100 μL5000个细胞,建议3-5个复孔将培养板在培养箱预培养适当时间 (例如: 6,  12, 24小时)。

注意:

² 每孔所用的细胞的数目需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定。建议第一次实验时先预实验确定每孔细胞加入量和CCK-8加入后的培养时间。

² 注意每孔接种细胞的均一性,注意在加细胞悬液过程中随时(比如每加3-5孔)摇动混匀细胞。

² 如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发问题。建议96孔板周围一圈改加相同量的PBS或培养液,不作为检测孔。

2. 向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。如果测定细胞活性,则不需要2-3步骤,直接从第4步操作。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,  12, 24或48小时)。

4. 向每孔加入10 μL CCK-8溶液

注意:

² CCK-8打开前请先离心。

² CCK-8加入量根据培养体积确定,添加量为10ul/100ul培养体积。建议加CCK-8后轻摇培养板混匀。

² 如果细胞培养时间较长,培养基颜色发生变化,建议更换培养基后再加CCK-8检测。细胞培养基酚红不影响测定结果。

² 不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数

² 为了使CCK-8试剂盒培养基充分混匀,减少CCK-8在移液器上的残留,建议加样前用培养基稀释CCK-8试剂,混匀后加样。

² CCK-8试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化反应,如果待检测体系中有较多还原剂(或抗氧化剂)会造成背景OD值升高,干扰检测结果。如果实验中有还原剂,请检查背景的O.D值,即测定、比较空白培养基加入药物与不加药物的培养基(含细胞)在加入CCK- 8试剂后的O.D值,如果空白O.D值明显偏高,则说明有反应,应设法去除或折算干扰因素。

5. 将培养板在培养箱内孵育0.5-4小时。

注意:

² 对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在0.5124小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

注意:

² 如无450nm滤光片,可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长,例如650nm,作为参考波长进行双波长测定。

² 如果暂时不测定OD值,每孔加入10 μL 1% SDS0.1 M HCL,盖好盖子,避光室温保存,可以延迟测量吸光值的时间。